Activity Assay:Article Title: 新型抗菌肽KR-1的设计、筛选及抗菌活性评价
Article Snippet: 共聚焦显微镜(CLSM)观察结果示,染料SYTO ® 9和PI的混合物分别对带有完整细胞膜的活细菌染色为荧光绿色,对带有损坏细胞膜的死细菌染色荧光红色。阴性对照组中, S. mutans ATCC 25175能形成较致密而厚的生物膜,红色荧光信号较弱。当在已形成的 S. mutans 生物膜中加入KR-1和CHX后,细菌生物膜活性明显降低,红色荧光信号增多,而且生物膜较疏松( )。 fig ft0 fig mode=article f1 fig/graphic|fig/alternatives/graphic mode="anchored" m1 Open in a separate window 5 caption a7 KR-1对 S.mutans 成熟生物膜的影响 Effect of KR-1 on mature S. mutans biofilm. .. KR-1对其他较常见的口腔链球菌也具有一定的作用( ),但对不同细菌作用效果均有所差异,其对于 S. mutans ATCC 25175的抗菌活性最好,MIC为3.2 μmol/L,MBC为6.4 μmol/L;对于 S. sobrinus 的作用效果较差,51.2 μmol/L的KR-1才能抑制其生长,而杀菌浓度则要大于102.4 μmol/L。然而粪肠球菌对于KR-1的敏感性很低,KR-1无法杀灭粪肠球菌,并且对其生长也没有明显抑制作用。 table ft1 table-wrap mode="anchored" t5 2 caption a7 Species Strain MIC (μmol/L) MBC (μmol/L) S.mutans ATCC 25175 3.2 6.4 S.sobrinus ATCC 33478 51.2 > 102.4 S.gordonii ATCC 10558 6.4 51.2 S.sanguinis JCM 5708 12.8 51.2 E.faecalis ATCC 29212 >102.4 >102.4 Open in a separate window KR-1对其他口腔链球菌的抗菌活性 Antibacterial activity of KR-1 against other oral Streptococci species 通过杀菌时效实验,进一步对抗菌肽的抗菌活性进行验证,MBC(6.4 μmol/L)浓度的KR-1作用下,5 min内可降低约95%的 S. mutans ATCC 25175,对于其他口腔链球菌的作用也是在5 min内即可杀灭90%以上( );2MBC(12.8 μmol/L)浓度的KR-1作用下趋势类似( ),其对于 S. mutans ATCC 25175的作用更加迅速,1 min内即可下降约98%,对于其他口腔链球菌的杀灭效果也更加迅速。 fig ft0 fig mode=article f1 fig/graphic|fig/alternatives/graphic mode="anchored" m1 Open in a separate window 6 caption a7 KR-1对口腔链球菌的杀菌时效曲线 Time-killing curve of KR-1 at 6.4 μmol/L ( A ) and 12.8 μmol/L ( B ) against oral streptococcus. .. 目前抗菌肽在细菌性疾病防治中的研究已经较为广泛,但仍有部分局限性例如杀菌效率较低、生产成本昂贵、合成具有不稳定性等。本研究以天然抗菌肽的类似物Dhvar4为模板,运用两亲性正电性α-螺旋抗菌肽的设计理念,采用残基替换的方式,对其结构进行改造,设计出新型抗菌肽测定其抗菌活性,筛选出了高活性低毒性且杀菌较为迅速的短链抗菌肽KR-1。目前自然界存在的抗菌肽相对分子质量一般在2000~7000左右,由20~60个氨基酸残基组成。本研究合成并筛选出的目标抗菌肽KR-1分子量为1938.49,且仅含14个氨基酸,结构为线性短肽,合成简单且成本低,肽链稳定性较高,不易发生空间结构变化。 KR-1的结构符合两亲性正电性α-螺旋抗菌肽的设计原则。由于色氨酸具有疏水性,本研究中使用色氨酸替换非极性面上带电性氨基酸和弱疏水性氨基酸。Liang等 [ 24 ] 研究表明,多肽疏水性与抗菌活性之间具有明显的正比相关,疏水性决定了抗菌肽破裂菌膜的能力,疏水性越高,抗菌活性越强。然而本研究发现,经改造设计后,KR-1、KR-2的疏水性均大于Dhvar4,但疏水性最强的KR-2,MIC反而最高,也就是说,当抗菌肽的疏水性超过某个特定的阈值时,随着疏水性的增加,可能抗菌活性反而降低,所以成功设计高活性抗菌肽需要恰当提高其疏水性。有研究发现 [ 25 ] ,超过6个净正电荷时抗菌肽抗菌活性提升不明显,甚至可能会因为同名电荷之间相互排斥而活性降低,带有4~6个正电荷的抗菌肽往往具有较好的抗菌活性。因此,本研究构建的KR-1、KR-2抗菌肽带有6个净正电荷,结合适当的疏水性设计,成功合成具有理论可行性的新型抗菌肽,后续的抗菌活性实验结果也进一步证明了此结论。 生物相容性的对比也是筛选目标抗菌肽中的重要环节。本研究中的KR-1、KR-2是对Histatin5衍生肽Dhvar4再次设计优化。Histatin5作为人源性抗菌肽具有人类唾液的正常成分优势,对宿主组织没有明显的不良影响 [ 26 ] 。但经活性改造后毒性往往会增加,随着结构上疏水性的增加,细胞毒性往往也随之增加 [ 27 ] ,实验证明,高浓度的抗菌肽确实对HGFs产生了一定的细胞毒性,但在药物有效浓度内,即MIC浓度下,KR-1作用于兔血红细胞的溶血率仅约为0.35%,作用于HGFs存活率高达92.43%,这反映KR-1仍然具有较好的生物相容性,因此若严格控制处理时间,可能难以产生明显的毒副作用。 牙菌斑生物膜是导致龋病发生的始动因子,因此在药物防龋方面,抑制 S. mutans 生物膜的形成和清除成熟生物膜具有重要意义 [ 28 ] 。KR-1能够明显减少形成的生物膜量,使用0.6×MIC的KR-1时,在抑制生物膜形成方面的效果与阳性对照药物CHX相当。随着作用浓度增大,KR-1对 S. mutans 生物膜的抑制效果优于CHX。这表明其具有良好的体外抑制 S. mutans 生物膜的效果;共聚焦显微镜定性结果示,KR-1也比CHX能更高效地清除成熟的 S. mutans 生物膜;经抗菌肽处理后的 S. mutans 生物膜变得不完整和疏松,这可能使后续的机械清除变得更加高效。因此,KR-1或许能够成为一种有效的抗生物膜药物,尤其是抗 S. mutans 生物膜。 KR-1不仅能够有效抑制口腔致龋菌 S. mutans 的活性,还可以抑制其他口腔致病菌的活性,比如其他龋病相关的病原菌 S. sobrinus 和 S. gordonii 。因此KR-1或许可用于口腔细菌感染性疾病的预防和治疗。KR-1具有较为快速的杀菌能力,在特定时间内, S. mutans ATCC 25175对KR-1的敏感性较其他实验组细菌更高。值得注意的是,在一定时间内相对于其他口腔致病菌,KR-1表现出对 S. sanguinis 较低的敏感性。口腔常驻菌 S. sanguinis 目前被认为是口腔有益菌,研究表明 [ 29 ] S. sanguinis 可显着减弱 S. mutans 在口腔和牙面定植,降低高度致龋的条件下光滑面龋的严重程度。KR-1更有选择性地抑制高致龋性链球菌的生长和代谢,在较少影响口腔有益菌的情况下对致病菌表现出较强烈的作用,而不会强烈影响低致龋性链球菌,对维护口腔常驻的“健康”微生物群落的稳定具有重要意义。 时效实验测量了抗菌肽杀灭细菌的速度,结果表明,KR-1对被测菌株作用迅速,随着肽浓度增加,杀灭时间降低。KR-1对口腔常见致病菌的最佳体外处理时间为1~3 min,此时间可杀灭约93%的 S. mutans 。一般来说,口腔冲洗用药及含漱液在口腔内停留时间较短,日常刷牙时间也在3 min左右,该作用效果符合口腔科用药规律,KR-1的快速杀菌性能增加了其临床应用的潜力。 然而,本研究也具有一定局限性,人类牙齿表面和口腔软组织上存在着700多种细菌,牙菌斑也是由多种细菌构成的生物膜 [ 30 ] ,可导致多种口腔疾病包括龋齿、牙髓炎、牙龈炎和牙周炎等疾病 [ 31 - 32 ] 。本篇研究的范围仅涉及KR-1对变异链球菌及部分口腔链球菌的作用效果,今后还需要观察KR-1对含有多种细菌的复杂菌斑生物膜的影响,并使用动物模型模拟更真实的口腔微生物环境,进一步研究KR-1对龋病以及其他口腔细菌性疾病的防治效果。 本研究设计、构建并筛选出了具有高活性且低毒性的新型抗菌肽KR-1,对多种口腔致病菌具有快速、高效的抑制及杀灭作用;结果表明,其在有效浓度内具有较好的生物相容性,短时间内具有一定的杀菌选择性,还具有良好的抗生物膜特性,有望成为防治口腔细菌性疾病的新型药物,尤其在龋病防治领域可提供新的思路。
Article Title: 新型抗菌肽KR-1的设计、筛选及抗菌活性评价
Article Snippet: .. KR-1对其他口腔链球菌也具有抗菌活性 KR-1对其他较常见的口腔链球菌也具有一定的作用( ),但对不同细菌作用效果均有所差异,其对于 S. mutans ATCC 25175的抗菌活性最好,MIC为3.2 μmol/L,MBC为6.4 μmol/L;对于 S. sobrinus 的作用效果较差,51.2 μmol/L的KR-1才能抑制其生长,而杀菌浓度则要大于102.4 μmol/L。然而粪肠球菌对于KR-1的敏感性很低,KR-1无法杀灭粪肠球菌,并且对其生长也没有明显抑制作用。 table ft1 table-wrap mode="anchored" t5 2 caption a7 Species Strain MIC (μmol/L) MBC (μmol/L) S.mutans ATCC 25175 3.2 6.4 S.sobrinus ATCC 33478 51.2 > 102.4 S.gordonii ATCC 10558 6.4 51.2 S.sanguinis JCM 5708 12.8 51.2 E.faecalis ATCC 29212 >102.4 >102.4 Open in a separate window KR-1对其他口腔链球菌的抗菌活性 Antibacterial activity of KR-1 against other oral Streptococci species 通过杀菌时效实验,进一步对抗菌肽的抗菌活性进行验证,MBC(6.4 μmol/L)浓度的KR-1作用下,5 min内可降低约95%的 S. mutans ATCC 25175,对于其他口腔链球菌的作用也是在5 min内即可杀灭90%以上( );2MBC(12.8 μmol/L)浓度的KR-1作用下趋势类似( ),其对于 S. mutans ATCC 25175的作用更加迅速,1 min内即可下降约98%,对于其他口腔链球菌的杀灭效果也更加迅速。 fig ft0 fig mode=article f1 fig/graphic|fig/alternatives/graphic mode="anchored" m1 Open in a separate window 6 caption a7 KR-1对口腔链球菌的杀菌时效曲线 Time-killing curve of KR-1 at 6.4 μmol/L ( A ) and 12.8 μmol/L ( B ) against oral streptococcus. .. 本实验根据Histatin5来源的Dhvar4序列进一步进行修饰和加工得到新型抗菌肽KR-1、KR-2。分析获得Dhvar4的极性面和非极性面上氨基酸的信息后,使用色氨酸替代丝氨酸以及使用色氨酸替代丝氨酸和碳端的酪氨酸,分别构建Dhvar4的2个衍生肽序列( , )。 table ft1 table-wrap mode="anchored" t5 1 caption a7 Antimicrobial peptide Sequence Net Charge Hydrophobicity Hydrophobic moment S.mutans ATCC 25175 MIC (μmol/L) MBC (μmol/L) Dhvar4 KRLFKKLLFSLRKY-NH 2 +6 0.380 0.592 6.4 12.8 KR-1 KRLFKKLLFWLRKY-NH 2 +6 0.544 0.639 3.2 6.4 KR-2 KRLFKKLLFWLRKW-NH 2 +6 0.636 0.723 12.8 25.6 Open in a separate window Dhvar4及其衍生肽的理化性质及抗菌活性 Physicochemical properties and antibacterial activity of Dhvar4 and its derivative peptides fig ft0 fig mode=article f1 fig/graphic|fig/alternatives/graphic mode="anchored" m1 Open in a separate window 1 caption a7 Dhvar4及其衍生肽的螺旋示意图 Helical wheel of Dhvar4 and its derivatives.
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